액체크로마토그래피의 원리 및 이해

액체 크로마토그래피의 원리 및 이해 - HPLC theory HPLC Theory / HPLC 2010/02/16 23:45 http://blog.naver.com/lovecat2010/10080977084 Theory of High Performance Liquid Chromatography(HPLC) 액체 크로마토그래피 원리 및 이해   Abstract 크로마토그래피의 역사(History of Chromatography)     크로마토그래피 : 시료 중 혼합 성분을 단일 성분별로 분리하는 분석기술   분리: 이동상과 고정상 사이의 상호작용(흡착. 분배)에 의한 물질의 분리   Chromatography 어원 Chrom: 색(Color) Graphein: 기록(Graphy, record)   Mikhail Tswett: 식물잎의 엽록소(클로로필과 크산토필..) 분리하기 위하여 유리관에 흡착제(탄산칼슘)를 충진시켜 석유에테르를 사용하는 실험을 고안하여 이 방법을 Chromatography라 명명함.   1905: Ramsey Charcoal과 같은 흡착제를 이용하여 가스와 증기의 혼합물 분리   1906: Michael Tswett 액체 크로마토그래피 이용하여 식물색소 분리-처음으로  Chromatography란 용어 사용   1941: Martin & Synge 액체-액체 크로마토그래피 개발   1952: James & Martin 가스-액체 크라마토그래피 개발   정식분류: Gas-Liquid Chromatography이며, 실제로 가스(Gas) 샘플 외에 대부분의 경우 액상 시료를 도입하여 분석하는 경우가 많다.   HPGC – 현대의 모든 산업, 의료 및 연구를 비롯한 다양한 분야에서 매우 유용하게 사용되는 분리분석 기술로써 시료의 정성, 정량 분석에 사용된다. 1960년대 후반 정교한 제어가 가능한 고압펌프의 개발로 고압액체 크로마토그래피(High Pressure Liquid Chromatography)에 의해 분석시간이 획기적으로 줄었으며, 상업적인 판매도 매우 증가하였다. 현재는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC: High Performance Liquid Chromatography) 시스템이 입반화되었으며,  10,000psi 이상의 고압을 지원하는 초고성능 액체 크로마토그래피(UPLC: Ultra Performance Liquid Chromatography )도 개발되어 사용되고 있다. 그러나, 현재 많은 양의 시료에 대한 빠른 분석을 요구하는 제약, 생동성실험관련분야를 제외한 일반적인 실험조건에서는 아직 HPLC 시스템이 범용적으로 사용되며, 그 이유는 UPLC 의 빠른 분석능력에도 불구하고, 컬럼의 손상 및 HPLC 시스템으로 대부분의 분리 분석 시험이 가능하기 때문이다.     HPLC system Type   크로마토그래피 시스템은 크게 가스 크로마토그래피(GC), 겔 크로마토그래피(Gel chromatography), 액체 크로마토그래피(LC)로 분류할 수 있다. 가스 크로마토그래피 시스템은 휘발성 샘플 분리 및 분석에 사용되며, 겔 크로마토그래피 시스템은 분자량이 2000이 넘고 비-휘발성 샘플을 분석하는데 사용된다. 액체 크로마토그래피는 분자량이 2000 이하인 비-휘발성 시료 분석에 사용된다.       HPLC system Configuration   HPLC 시스템은 천연물을 비롯하여 식품, 농약, 생명공학, 신약개발 등 다양한 분야에서 가장 많이 사용되고 있다.  HPLC를 이용한 분리분석의 기본적인 원리는 액체 크로마토그래피와 동일하며, GC 시스템과 마찬가지로 고정상(stationary phase)과 시료(sample) 및 이동상(mobile phase)와의 상호작용이 시료 성분의 분리에 영향을 미치지만, 액체 크로마토그래피 시스템은 가스 크로마토그래피 시스템과는 달리 분석 가능한 분자량의 제한이 없다. 즉, HPLC 는 GC에 비해 비교적 분자량이 크거나 비-휘발성인 시료를 분석할 수 있으며, 분석한 시료의 회수가 가능하다는 장점이 있다. GC HPLC 시료의 휘발성 시료의 용해성 열적 안정성 pH 안정성 M.W <500 M.W 제한 없음 고정상의 선택성 고정상과 이동상의 선택성 시료 회수가 불가능 시료 회수 가능 고-감도 검출능력 상대적으로 감도가 낮음 <GC 와 HPLC 비교>   HPLC 시스템의 구성은 일반적으로 아래와 같다. ü  이동상 중의 용존산소, 질소, 기포 등을 제거하기 위한 탈기장치(Degasser) ü  이동상인 용매(Eluents)를 운송하기 위한 고압 펌프(pump) ü  시료를 주입하기 위한 주입장치(Injector) ü  혼합된 시료의 분배가 일어나는 컬럼(Column) ü  성분의 검출을 위한 검출기(Detector) ü  기기제어 및 시그널 수집 분석하는 제어시스템(Integrator:컴퓨터+소프트웨어)       <고성능 액체 크로마토그래피 시스템 기본 구성도> 탈기장치 (Degaser) 펌프 (Pump) 시료주입기 (Injector) 컬럼/온도조절기 (Column / Oven) 검출기 (Detector)   HPLC system   HPLC tower type & HPLC module type HPLC-MS system     1. 탈기장치: Degasser 이동상 중의 용존산소, 질소, 기포 등을 제거하여 컬럼 내에서 이동상(mobile phase)에 대한 댐핑 현상을 줄여주는  장치이다. 탈기방법으로는 이동상 용매에 헬륨 가스를 주입하여 용존된 기포 등을 제거하는 헬륨 퍼징 (Helium sparging) 혼합된 이동상 용매를 멤브레인 필터를 이용하여 여과(membrane filtering vacuum filteration), 강력한 초음파를 이용하여 탈기하는 방법(ultra-sonication) 등이 사용된다. 현재 대부분의 제조사에서 채용하는 탈기방법은 액체 크로마토그래피 시스템의 펌프에 직접 연결된 on-line degasser를 장착하고 있다. On-line degasser 탈기장치는 용매가 일정한 진공상태가 유지되는 챔버 속에 장착된 membrane tube를 지나가도록 하여 gas가 membrane tube 밖으로 배출되고 용매만 통과하여 펌프로 공급하는 방식이다. <On-line degasser>   탈기 효율 비교   송액장치(Pump)   HPLC 시스템의 펌프의 역할은 이동상으로 사용되는 용매를 저장용기로부터 시료주입기를 거쳐 컬럼으로 연속적으로 보내어 최종적으로는 검출기를 통과한 후 이동상인 용매와 시료 주입기를 통해 주입된 시료가 밖으로 나올 수 있도록 압력을 가해 주는 장치이다. 따라서, 펌프는 일정한 압력과 유속을 유지할 수 있도록 해야하며, 다양한 용매를 사용할 수 있으며, 또한 용매에 대한 내구성이 뛰어나야 한다.   펌프의 종류에는 Isocratic pump와 Gradient pump 가 있으며 현재 다양한 용매의 기울기를 보정하여 분석시간 동안 이동상의 조성을 시간의 흐름에 따라 조절함으로써 분석조건을 향상시킬수 있는 gradient pump가 주로 사용된다. Gradient Pump의 경우 2가지의 용매를 사용하여 분석하는 방법 또는 3가지의 용매를 사용하여 분석할 수 있도록 되어 있다.     Isocratic pump(단일용매펌프): 분석시간 동안 이동상 용매 조성의 변화가 없다. Gradient pump: 분석시간 동안 이동상 용매 조성의 변화를 조절할 수 있다. -       Binary pump(2개 용매펌프) 와 Quaternary pump(4개 용매펌프)   <단일 용매 펌프>   <이중 용매 펌프>   <사중 용매 펌프>       시료주입기(Injector) 분석하고자 하는 시료를 용매의 흐름에 실어주는 것으로써 샘플을 주입하는 방식에 따라 크게 자동시료주입기 (Auto Injector/Autosampler) 와 수동시료주입기(Manual Injection)로 구분할 수 있다.   a. Manual Injection – 수동 시료주입기 (루프 타입:Loop)       b. Auto Injection 자동시료주입기는 많은 양의 시료에 대한 연속적인 주입 및 사용의 편의성을 확보할 수 있으며, 샘플 루프에 분석하고자 하는 시료를 채운 후 밸브를 회전하여 포트를 변경함으로써 이동상으로 사용되는 용매의 흐름에 실어주는 역할을 한다.   <자동시료주입기 밸브 포지션>     컬럼(Column) - 컬럼의 구성은 관 모양의 용기에 충진제를 채워서 사용하도록 구성되어 있으며, 분석시료의 종류에 따라 컬럼의 크기 및 충진제의 종류를 선택하여 사용한다. - 컬럼의 역할은 GC와 마찬가지로 혼합상태의 시료를 화학적/물리적 특성에 따른 머무름(retention) 정도의 차이에 의해 혼합성분을 단일성분으로 분리한다. - 컬럼의 종류는 순상, 역상, 이온, 크기배제 컬럼 등이 있다. - 컬럼 선택시 고려할 점은 다음과 같다. - 충진제의 재질 - 충진제의 입자 크기 - 충진제의 형태 - 충진제의 pore size   충진제의 입자 크기가 작을수록 분리 효율은 증가하며, Back pressure도 증가한다. 입자크기 용도 5 µm 높은 분리효율과 적합한 작동압력을 제공. 분석용 컬럼으로 가장 많이 사용됨 3 µm 분석시간의 단축할 수 있으나 컬럼 제작에 어려움이 있다. 10 µm QA 목적 실험이나 분취 목적등으로 많이 사용된다. > 10 µm 분취 목적 응용에 사용.     a. Normal Phase(흡착작용) à Functional Group(작용기)의 Polarity에 의해 분리가 일어난다. à 일반적으로 non-aqu., non-polar solvent를 사용하여 극성이 큰 물질이 나중에 용출된다.   b. 역상 컬럼(분배 작용) à Bonded compound(C18, C8, CN,ph)와 분석 물질 간의 상호작용에 희한 분리가 일어난다. à 일반적으로 polar solvent를 사용하며 비극성이 큰 물질이 나중에 용출된다.   c. 이온교환 컬럼(Ion Exchange) à 이온화도 차이에 의해 분리가 일어난다.   d. Size exclusion(분자체 작용: 크기 배제)       컬럼 선택 프로세스 1.     분석하고자 하는 시료의 물리. 화학적인 특성 검토 2.     분리에 적합한 컬럼 선택(충진제의 극성도, 입경, 컬럼의 내경 및 길이를 고려) 3.     표준품을 이용한 크로마토그램 획득 4.     최적효율의 분리를 위한 용매의 조성비 결정 5.     피크의 분리간격 최적화 6.     피크의 분리가 적합하지 않은 경우 컬럼 변경       컬럼 온도 조절기(Column Temperature Control Oven) 분리능 향상 및 분석 결과의 재현성 보장을 위해 컬럼 온도를 적절하게 설정 유지한다. 1개의 컬럼 장착용 또는 여러 개의 컬럼을 장착할 수 있는 제품도 있으며 대부분의 제품은 최대 80°C ~90°C 온도범위로 0.1°C 단위로 제어가 가능하다. 또한 멀티 컬럼 오븐의 경우 컬럼 스위칭 기능을 가진 제품도 있다. 컬럼 인식 기능을 가진 제품이 사용이 편리하다.     검출기(Detector)   컬럼에서 분리된 시료가 일정한 간격으로 검출기를 통과할 때 시료의 존재 및 양을 일정한 규칙에 의해 인식하여 전기적인 신호로 바꾸어 준다.   컬럼의 종류 * 가변파장 검출기(Variable Wavelength Detector) * 다이오드 어레이 검출기(Diode-Array Detector) * 형광 검출기(Fluorescence) * 굴절률 검출기(Refractive Index Detector) * 전기화학 검출기(electrochemical Detector) * 전도도 검출기(Conductivity Detector)       a. UV-Vis Detector 가장 많이 사용되고 있는 검출기로써 화합물이 빛을 흡수하는 성질을 이용한 방법이다. 즉, 화합물들 중에는 자외선 혹은 가시광선 영역의 빛을 흡수하는 성질을 가진 화합물들이 있는데, 이들이 검출기의 셀을 지나면서 흡수한 빛의 양을 전기적인 신호로 바꾸어 주는 원리를 이용한 것이다. UV-Vis 검출기는 약품, 식품, 향료, 펩타이드와 단백질 및 비타민 등의 다양한 분야에서 폭넓게 사용되고 있다.   UV-VIS 검출기의 종류   고정형 흡광도 검출기(Absorbance Detector): 측정하고자하는 파장이 필터에 따라 결정이 되어 있어서 몇 개의 고정된 형태(214, 229, 254, 265, 280, 313, 405, 436, 536nm)의 파장만을 사용할 수 있다.       가변형 흡광도 검출기(Variable wavelength Detector:VWD): 일반적으로 190nm-600nm 사이의 파장 중에서 원하는 파장을 선택하여 사용함으로써, 고정형에 비하여 다양한 파장을 선택할 수 있으며, 2~5개의 파장을 동시에 선택할 수 도 있어서 매우 편리하다.     광다이오드 배열 검출기(Photo-Diode Array Detector:DAD): 흡수셀을 통과한 빛을 다이오드 배열판으로 반사시켜서 190nm-900nm까지의 전 파장을 동시에 검출할 수 있다. DAD 검출기는 신속하게 모든 파장의 스펙트럼 인 및 다파장 검출이 가능하고, 탁월한 파장 재현성을 갖는다. 또한 컴퓨터 소프트웨어를 이요하여 수집한 결과를 3차원적인 크로마토그램의 해석이 가능하다.     b. 형광 검출기(Fluorescence Detector) 분자는 외부로부터 에너지를 흡수하게 되면 들뜬 상태로 되었다가 안정화되기 위하여 에너지를 방출하면서 기저상태로 돌아가려는 성질을 가지고 있는데, 이러한 과정에서 빛이나 열 혹은 소리 등을 발생시킨다. 형과검출기는 이러한 에너지 평형상태 중에 형광을 발생하는 화합물을 특이적으로, 검출하는 검출기로써 흡광도 검출기에 비하여 10-100배 이상의 우수한 감도를 가진다.   광원(Light Source)은 주로 수은등을 사용하는데, 연속광원인 크세논을 사용하는 분광형광 검출기도 있으며, 레이저를 광원으로 사용하여 감도를 더욱 향상시킨 제품도 생산되고 있다.   형광 검출기는 제약분야의 임상시험 시료나 생명과학 분야에서 아미노산 분석을 비롯한 환경, 식품 등 다양한 분야에서 사용되고 있다.     c. 굴절률 검출기(Refractive Index Detector) 굴절률 검출기는 시료가 가지는 농도의 변화에 따르는 빛의 굴절률의 차이를 측정하는 것이다. 셀은 시료가 통과하는 샘플셀(sample cell)과 이동상만으로 채워진 기준셀(reference cell)로 구성되어 있으며, 분석시간 동안 reference cell은 이동상만으로 채워지고, 시료를 포함한 이동상은 sample cell을 통과하여 흐른다. 이 때 두 cell의 농도차에 의한 굴절률의 차이가 발생하는데, 이를 전기적인 신호로 나타내어 크로마토그램으로 화면에 나타난다.   굴절률 검출기는 거의 모든 화합물에 대하여 감도를 나타내지만, 흡광도 검출기나 형광 검출기에 비하여 감도가 낮고, 이동상의 유속과 온도에 대해서 매우 민감하게 반응한다.   굴절률 검출기는 흡광도 검출기나 전기전도도 검출기에서 검출이 안되는 고분자 화합물이나 당 등의 분석에 주로 이용된다.     d. 전기화학 검출기(electrochemical Detector) 전기화학 검출기는 정전위 전기분해가 가능한 화합물을 선택적으로 검출할 수 있다. 셀의 내부로 들어간 시료는 일정한 전압이 걸린 기준전극의 전위를 기준으로 하여 작업전극과 보조전극의 전기화학반응 즉, 산화환원반응에 의한 전자의 이동이 일어나며, 이 때에 발생하는 전류의 양을 측정하여 크로마토그램으로 시각화하는 방법으로 정량분석을 하게된다.   전기화학 검출기는 제약 및 생명과학 분야에서 catecholamine류 및 tryptophan 대사물 등의 분석과 환경분야의 페놀이나 무기 및 유기금속 화합물류 분석, 식품중의 당 분석 등에 이용된다.     e. 전기전도도 검출기(Conductivity Detector) 전기전도도 검출기(conductivity Detector)는 두 전극 사이의 전기전도도 차이를 이용한 것으로 이동상만이 흐르던 셀의 내부로 용해된 시료가 통과하게 되면 두 전극 간의 저항값이 달라지게 되고, 이러한 차이를 전기적인 신호로 바꾸어서 크로마토그램으로 해석할 수 있다.     이동상 용매 HPLC 시스템에서 용매는 이동상으로써의 역할 뿐만 아니라 고정상과 시료와의 친화도에 영향을 미치는 주요한 인자로써 역할을 한다. 이동상 용매로써 사용되는 모든 용매는 HPLC용으로 만들어진 HPLC grade를 사용하는 것이 바람직하다. 또한 극성도를 조절하기 위해서 사용하는 물 또한 저항값이 18MΩ 이상인 초순수 등급 물을 사용해야 한다. 또한 용매들은 분리하고자 하는 시료를 녹일수 있어야 하며 측정하고자 하는 파장보다 낮은 UV cutoff값을 가지고 있어야 한다.   HPLC 용매의 UV에서의 Cutoff 값 Solvent UV cutoff Solvent UV cutoff Water 180 n-Heptane 197 Methanol 210 Cyclohexane 200 n-Propanol 205 Carbon tetrachloride 265 Acetonitrile 190 Chloroform 245 THF 230 Benzene 280 Acetone 330 Toluene 285 Methyl acetate 260 Methylene Chloride 232 Ethyl acetate 260 Tetrachloroethylene 280 Nitromethane 380 1,2-Dichlorethane 225   a. 용매의 세기 용매의 강도는 위의 표와 같이 역상(Reverse phase) 그리고 순상(normal phase)에 따라 서로 반대의 강도를 가지게 되며, 역상에서는 유기용매와 물의 혼합시에 물의 함량이 많아질수록 성분의 머무름 시간(retention time)은 길어지게 된다.   Solvent Strength Reversed Phase Normal Phase Water Hexane DMSO 1-Chlorobutane Methanol Methylene Chloride Acetonitrile Acetonitririle Tetrahydrofuran       b. 용매의 섞임성 HPLC에서 단일 용매를 사용하는 경우는 거의 없고, 대부분 혼합용매를 사용하기 때문에 용매는 섞임성이 있어야 한다. 또한 사용하는 컬럼의 종류에 따라서 이동상으로 사용하는 용매의 극성도와 이온화 정도 및 친유성, 친수성 등을 고려하여야 한다. 서로 섞이지 않는 용매를 동일한 HPLC 시스템에 사용하게 되면 컬럼의 치명적인 손상을 초래할 뿐 아니라 전체 시스템에서 막힘현상이나 염의 석출 등이 발생하게 되므로 주의하여야 한다. 따라서 섞임성 이 용매를 교환하고자 할 경우에는 컬럼을 제거한 후 isopropyl alcohol 또는 tetrahydrofuan 등의 양성 용매로 충분히 세척한 후에 원하는 용매를 흘려 주어야 한다.   c. 용매의 여과 HPLC에 사용되는 컬럼은 수µm 단위의 매우 미세한 입자로 충진되어 있기 때문에 이동상에 포함된 미세입자들이 컬럼을 막는 경우를 방지하기 위하여 이동상 및 시료 등은 반드시 여과하여 사용하여야 한다. 여과장치와 필터를 이용하여 여과하며, 용매 저장병에는 금속 필터를 이용하여 미세입자가 컬럼 내부로 유입되는 것을 방지해 주어야 한다. 그러나 이러한 노력에도 불구하고 컬럼은 자주 막히게 되는데, 대부분의 원인은 시료 속의 미세입자 등에 의해서 컬럼의 입구가 막히는 경우 또는 시료 및 시료 중의 불순물이 이동상 용매에 완전히 용해되지 않았기 때문이다. 시료를 용매에 주입하기 전에 사용하는 필터의 경우 지용성과 수용성이 있으므로 적절하게 선택해서 사용해야 하며,  여과하는 시료의 오염 정도와 양에 따라서 적당한 필터의 직경을 선택하여 사용해야 한다.   d. 이동상 용매의 제조 이동상으로서의 조건을 만족하는 용매를 선정하고, 미세먼지 등의 이물질을 제거한 용매는 이동상으로서 좋은 분리능을 가질 수 있는 알맞은 조성비로 섞어주게 된다. 대부분의 실험실에서는 용매를 기기분석실 내부에 저장하기 보다는 외부의 용매 저장소에 저장하는 경우가 많은데, 외부의 온도는 실험실의 온도와는 차이가 나는 경우가 있다. 이 경우 이동상으로 사용할 용매를 용매 저장고로부터 가져와서 곧바로 혼합하게 되면 온도의 차이에 따라서 용매 부피의 비율이 달라지는 경우가 있으므로 실헐실에서 충분한 시간을 방치한 후 혼합하도록 한다. 혼합할 때에는 각각의 용매를 부피 대 부피로 계량한 후 곧 바로 혼합하도록 해야한다. 각각의 용매를 부피의 비율로 섞지 않고 한 용매에 다른 용매를 섞으면서 용량을 맞추는 경우도 있는데, 이 경우 용매의 성질에 따라서 흡열 및 발열반응이 일어나며 부피의 비가 달라질 수 있다. 또한 용매의 섞임성이 일정하지 않아서 다음에 분석할 경우에 분석의 재현성이 떨어진다.     완충용액의 사용(Buffer Solution)   분석하고자 하는 시료가 이온성 시료일 경우에는 이온의 억제나 이온쌍의 형성을 위하여 완충용액(Buffer solution) 을 사용하는 경우가 있다. 이외에도 생리활성 물질 등을 순수분리하거나 정제할 때, 또는 pH를 조절할 목적, 이온성 물질을 분리할 때 이온강도를 조절할 목적으로 완충용액을 사용한다.   Component Component Sodium Chloride Magnesium Sulfate Calcium Chloride Sodium bicarbonate Potassium Chloride Sodium phosphate dibasic Potassium phosphate monobasic Glucose   UV/Vis 검출기의 발색단   UV-Vis 검출기에서 분석하고자 하는 물질은 이 검출기에서 흡광도를 가져야 한다. 모든 물질이 자외선 및 가시광선부에서 빛을 흡수하는 것이 아니므로 각 물질의 분자 내에 대표적인 흡수 스펙트럼을 가지는 구조가 존재하는지를 먼저 조사하여야 한다.   Chromophore Structure λ max(nm) Amine -NH2 195 Ethylene -C=C- 190 Ketone =C=O 195 Ester -COOR 205 Aldehyde -CHO 210 Carboxyl -COOH 200~210 Nitro -NO2 310 Phenyl   202, 255 Naphthyl   220, 275       Data process & Control software   HPLC 시스템의 제어는 크게 HPLC 시스템 본체의(최근에는 터치스크린방식)에서 콘트롤 또는 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 편리하게 제어, 데이터 수집, 결과도출, 성적서 출력까지 할 수 있다.         출처: www.konik-group.com         www.scinixkorea.com  [출처] 액체 크로마토그래피의 원리 및 이해 - HPLC theory|작성자 똘똘이스머프